DNA双链断裂可由外在因素（电离辐射和活性氧等）或内在因素（DNA复制错误和V（D）J重组等）造成，从而激发DNA损伤应答，包括DNA修复、细胞周期调控、细胞衰老和细胞凋亡等。DNA损伤应答由PIKK（phosphoinositide-3-kinase-related kinase）家族蛋白激酶催化下游蛋白的磷酸化而启动，包括DNA-PK（DNA依赖性蛋白激酶）、ATM（Ataxia Telangiectasia Mutated）和ATR（ATM-Related and Rad3-Related）三种激酶。其中，DNA-PK是非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）通路中的关键蛋白激酶，由DNA-PKcs（DNA-PK催化亚基）、Ku70/80和DNA末端组成，其全酶装配会进一步招募NHEJ相关的连接酶和修复蛋白，包括DNA连接酶IV、XRCC4（X-ray cross complementing protein 4）、XLF（XRCC4-like factor）和Artemis等。由于激酶结构域的底物结合口袋被其自身的PRD（PIKK regulatory domain）所阻挡，apo状态的DNA-PKcs的激酶活性处于抑制状态，DNA-PKcs只有在结合DNA末端和Ku70/80后，激酶活性才会被完全激活，从而启动NHEJ通路。NHEJ相关突变会引起生长迟缓、胚胎致死以及免疫缺陷等，同时DNA-PK还是关键的癌症药物靶点。

DNA-PKcs和DNA-PK大部分结构只有中等分辨率（4.3-6.6 Å），且存在建模错误【1-3】。最近，Blundell组报道了3.24 Å的apo-DNA-PKcs、3.9 Å DNA-PK单体和7.24 Å DNA-PK二体等的冷冻电镜结构，DNA-PK二聚化由Ku80的最靠近C端的⍺螺旋所介导，揭示了NHEJ通路初期DNA末端远端匹配的可能机制【4】。尽管如此，以上所有报道的结构都为抑制态，激酶结构域的激酶活性中心都处于封闭状态，无法解释DNA-PKcs是怎么结合Ku70/80和DNA末端以及怎么被它们激活的，且由于冷冻电镜map的局部分辨率不够高，无法较精确地描述蛋白-蛋白和蛋白-DNA作用界面以及无法解释已报道的DNA-PKcs的关键致病突变和磷酸化位点。

2020年12月31日，Molecular Cell在线发表了美国国立卫生研究院消化道、糖尿病和肾病研究所杨薇院士课题组与Martin Gellert院士课题组的研究成果：“Structure of an activated DNA-PK and its implications for NHEJ” （陈学敏博士为论文第一作者），他们报道了DNA-PKcs-DNA末端和DNA-PK全酶的不同状态的冷冻电镜结构（3.2-4.3 Å），首次展示了激活态DNA-PK结构，解释了DNA-PKcs亚基识别DNA末端和DNA-PK逐步被Ku70/80和DNA末端所激活的分子机制，为NHEJ通路中DNA-PK如何招募其他修复蛋白提供重要启示。

首先，作者通过在DNA的关键弯曲位置引入一个切刻，发现DNA-PK的激酶活性可被提高至少3倍。使用此切刻DNA，组装和纯化了DNA-PK蛋白样品并收集了大量冷冻电镜数据。电镜数据处理和3D分类发现，样品中存在不同状态的复合物结构，有DNA-PKcs-DNA末端（不含Ku70/80）和DNA-PK全酶两种组装状态，而两种状态又可细分为6种构象，命名为复合物I-VI。复合物I和II为DNA-PKcs-DNA末端复合物的两种构象，区别在于NH1亚结构域和DNA末端的位置不同，其激酶结构域都处于抑制状态。复合物III-VI为DNA-PK全酶的四种构象，其中III-V为抑制态，通过Ku70/80和DNA末端的充分结合以及DNA-PKcs的全局构象变化，最终DNA-PK转变为激活态复合物VI。

不同状态DNA-PK的总体结构。A为激活态DNA-PK复合物VI的结构模型；B为DNA-PK各亚基的结构域分布图以及全酶样品的SDS-PAGE图；C为不同状态复合物的冷冻电镜map。

通过结构比对发现，在DNA-PK激活过程中：DNA-PKcs的M-HEAT结构域在复合物I-VI之间只发生了轻微构象变化；N-HEAT的NH1亚结构域则发生逐步向上的构象变化，收紧N-HEAT环，最终与M-HEAT的MH3亚结构域和FAT的FR2亚结构域相互作用；FAT结构域内的相邻HEAT重复序列之间则发生相反反向的扭转和拉升，激活态复合物IV中FR2与NH1相互作用；最终，Ku70/80和DNA末端将DNA损伤信号通过DNA-PKcs亚基上的HEAT重复序列的“彩虹圈式”构象变化传递到激酶结构域，PRD发生115°外翻，解除激酶活性中心抑制态，暴露DNA-PK的底物结合口袋，催化DNA-PK自身和下游修复蛋白的磷酸化。令人意外的是，在DNA-PK组装和激活过程中，DNA-PKcs才是识别DNA末端的关键亚基，而Ku70/80的开放性拓扑结构只能在DNA主链上滑动，Ku70/80通过与DNA-PKcs的N-HEAT和M-HEAT结构域以及DNA的相互作用，进一步稳定了DNA-PK对DNA末端的结合，使DNA-PK在激活过程中不会松散。另外，本研究也更完全的揭示了Ku80-CTR结构域在DNA-PK激活中的重要作用，除了Ku70/80的核心（⍺/β结构域和β桶结构域）与DNA-PKcs的N-HEAT个M-HEAT结构域相互作用以外，Ku80-CTR的螺旋548-555、结构域595-706和螺旋724-732也分别固定了DNA-PKcs底座的四个角，对DNA-PK激活起到固定和促进作用。

DNA-PK激活过程中的结构变化A-D分别为N-HEAT、M-HEAT、FAT和激酶结构域的构象变化，PQR无序部分结构显示为虚线，底物ATP和多肽显示为棍棒模型，E为 激活态DNA-PK复合物VI的底部视图

DNA-PKcs含有两簇自磷酸化位点，位于M-HEAT两个无规区域，其中，PQR簇位于氨基酸序列1982-2093之间，ABCDE簇位于氨基酸序列2566-2788之间。虽然由于结构柔性，PQR簇的大部分loop区域无法搭建，但电镜map能够观察到其两个螺旋A7和A8 ，以前的结构模型错误地将A7归属于Ku80的CTR结构域，同时，由于分辨率的提高以及晶体结构[1]的硒代甲硫氨酸位置，也可以正确的定位和搭建螺旋A8，PQR簇远离DNA-PK自身活性中心且大部分结构都位于DNA末端延长位置上，因此作者推断PQR簇只能被相邻的DNA-PK分子磷酸化，以及其磷酸化将会在影响DNA-PK对DNA末端的结合和对其他修复因子的招募。在以前发表的DNA-PK结构中，只有Blundell组观察到了ABCDE簇的部分结构，位于M-HEAT大环内部，而杨薇组冷冻电镜map发现ABCDE簇位于M-HEAT大环外部（由于DNA末端与DNA-PKcs具有更紧密的结合），紧邻DNA-PK自身的激酶活性口袋，提示了ABCDE簇可以被DNA-PK自身磷酸化，同时结构比对发现，当DNA-PK从抑制态（复合物V）转变成激活态（复合物VI），DNA末端有一个大约2 Å的外移，因此可以推断，ABCDE簇在自磷酸化过程中，DNA末端变得更容易被NHEJ修复蛋白所捕获，从而被相关核酸酶、连接酶和修复蛋白处理和修复。另外，ABCDE簇的去磷酸化可以恢复DNA-PK让DNA末端再次被保护起来，从而形成DNA-PK的磷酸化-去磷酸化循环。

NHEJ通路中DNA-PK的运作模型

综上，该工作报道了DNA-PK的从抑制态到激活态一系列冷冻电镜结构，展示了断裂DNA末端是怎么被DNA-PKcs亚基感应并组装成全酶结构，再通过DNA-PKcs上的HEAT重复序列将信号传导到激酶活性中心，将DNA-PK从抑制态转变成激活态，从而磷酸化DNA-PK自身和大部分NHEJ修复蛋白，最终启动NHEJ通路来完成DNA修复。另外，该工作还提出，“彩虹圈式”的HEAT重复序列具有结构柔性，可能在很多含HEAT重复序列的蛋白中具有重要调控功能，如PIKK激酶、凝集素（Condensin）、黏附素（Cohesin）和核转运蛋白（Karyopherin）。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.12.015